Entstehung von Gefäß- und Kapillarendothelzellen aus HS/PC

(hematopoietischer Stamm- und Progenitor Zellen) und hPSC (humanen Pluripotenten Stammzellen)

Einleitung

Das entwicklungsgeschichtliche Verhältnis von hämatopoetischen- und Endothelzelllinien ist Gegenstand der Grundlagen- und der klinischen Forschung. Der gemeinsame Vorläufer beider Zelllinien, der hämatopoetischen und der endothelialen, der Hämangioblast wurde in vitro und in vivo bei wirbellosen und Wirbeltieren untersucht (Park et al 2005). Eine vergleichbare Hämangioblastenpopulation, die sich aus hESC (humanen embryonalen Stammzellen) entwickelte bildete „blast colony-forming-cells“, die sich sowohl in hämatopoetisches wie auch in endotheliales Gewebe differenziert (Kennedy et al. 2007). Das Wesen von Hämangioblasten wird immer noch untersucht und diskutiert (Chen et al.2015). Hämogene Endothelzellen sind Übergangsstufen, die zur Neubildung von multipotenten hämatopoietischen Stammzellen während der Embryogenese führen. Die molekularbiologischen Mechanismen dieser Entwicklung sind weitgehend unbekannt.

Extraembryonale Hämatopoese 

Die extraembryonale Hämatopoese und Endothelzellbildung finden außerhalb des Embryos im Dottersack, der als Plazenta funktioniert, statt. Der Dottersack ist eine zweilagige Struktur mesodermaler und entodermaler Abstammung, bestehend aus trophoblast und einer einschichtigen Lage von hypoblast. Aus der endodermalen Struktur entsteht ein Epithel, das als Leber und Intestinum funktioniert und aus der mesodermalen Zellschicht entstehen die ersten sichtbaren „Blutzellen“ des Dottersacks. Das sind großkernige primitive Erythroblasten (Palis et al.2001).

Es bilden sich Blutinseln im Dottersack. Die Außenschicht des Lumens wird von Angioblasten (Endothel-Progenitor-Zellen) gebildet, im Lumen finden sich lose embryonale hämatopoetische Zellen, die zu einer primitiven Hämatopoese und Zirkulation führen. In dieser primitiven Zirkulation finden sich neben primitiven kernhaltigen Erythroblasten auch Megakaryozyten und Makrophagen (Palis et al. 1999, Lichanska et al. 2000).

Die Hämatopoese eines Erwachsenen entsteht aus HSC (hämatopoetischen Stammzellen). Im Gegensatz dazu differenzieren primitive hämatopoetische Zellen aus bi-potenten Progenitoren, Hämangioblasten, aus denen Angioblasten entstehen die primitive Gefäße bilden (Auerbach et al.).  Hämangioblasten sind mesodermale Vorläuferzellen charakterisiert durch die Expression von Transkriptionsfaktoren brachyury und Flk1 (KDR oder VEGFR-2) (Ferkowicz et al. 2005). Im Dottersack können nur sehr wenige Hämangioblasten (Flk1+) entdeckt werden, weil sie sich vermutlich nur kurz in diesem Zustand befinden und rasch in hämatopoetische und vaskuläre Progenitorzellen weiter differenzieren und vermehren (Huber et al.). Chen et al. bezweifeln, dass es nicht gesichert ist ob primitive Erythrozyten, Megakaryozyten und Makrophagen direkt aus Hämangioblasten in der extraembryonalen Hämatopoese hervorgehen!

intraembryonale Hämatopoese (hPSCs (humane Pluripotente Stammzellen) differenzieren zu hämatopoetischen Zelllinien)

Hämogenes Endothel (HE) => endothelium-to-hematopoietic transition (EHT) => hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), (Zovein et al. 2008; Bertrand et al. 2010; Boisset et al. 2010; Kissa et al. 2010). Jaffredo et al. zeigten, dass der „Boden“ der Aorta reichlich CD45 exprimierende Zellansammlungen hämatopoetischer Abstammung beherbergt, während die übrigen Endothelzellen neben CD45-Markern auch Flk1 an der Zelloberfläche exprimieren. Diese erst kürzlich entdeckten Zellen enthalten Spuren von Dil-konjugierten LDLs anhand derer Endothelzellen der Aorta identifiziert werden (Jaffredo et al. 1998). Hämogenes Endothel (HE), das ist Blutzellbildendes Endothel und EHT kommt nur in bestimmten Regionen in einem begrenzten Zeitfenster während der Embryogenese vor. Es ist der Grundlagenforschung schwer zugängliche die zellulären und molekularbiologischen Abläufe zu verstehen, wie Blutbildende Zellen aus Endothelzellen hervor gehen. Dieser Vorgang wird als „Endothelial to hematopoietic-transition“ kurz EHT bezeichnet. Wie Hämatogenes Endothel in Hämatogenes Gewebe und weiter in hämatopoetische Stammzellen differenzieren ist weitgehend unbekannt. Gezeigt wurde, dass hämatopoetische Stammzellen aus hämogenem Endothel in die fetale Leber und das Knochenmark migrieren (Cumano 2001; Baron 2013; Clements 2013). In weitester Form sind diese Forschungsergebnisse von grundlegender Bedeutung, da diese zu einem grundlegenden Verständnis der Gewebeneubildung führen sollten. Die Regeneration und die Neubildung der Blutversorgung durch Gefäße und mikrovaskuläres Gewebe ist für den Erfolg rekonstruktiver chirurgischer Eingriffe entscheidend.

Hämatopoetische Differenzierung von human pluripotenten Stamzellen (hPSC)

3-D „embroid bodies“ der hPSC Differenzierung ahmen in vivo die embryonale Entwicklung der 3 Keimblätter nach. „Embryoid bodies“ sind Zellaggregate, die in Zellkulturen unter bestimmten Kulturbedingungen entstehen. In Versuchen mit Cystischen Embryoid bodies in verschiedenen Ko-Kulturen wurde gezeigt, dass hämatopoetische und vaskuläre Zelllinien von Hämangioblasten und hämogenem Endothel stammen, wie während der Embryogenese. Vodyanik 2005; Timmermans 2009 zeigten dies für Ko-Kulturen mit OP9 Stromazellen, Weisel 2006; Ledran 2008 für Ko-Kulturen mit Stromazellen des AGM, Ledran 2008, Ma 2008 für Ko-Kulturen mit Stromazellen der fetalen Leber, Kaufmann 2001; Tian 2006 bei S17BM-derived stromal cells.

humane pluripotente Stammzellen (hPSC) differenzieren zu hämatopoietischen Stamm- und Vorläuferzellen (HS/PC)

HSC sind seltene Zelllinien aus dem Knochenmark, erneuern sich selbst und differenzieren in verschiedenste Blutzellarten. Long-term HSC exprimieren CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA-, Lin- (Majeti 2007)

hPSC => HET => HE

Unterscheidung zwischen Hämangioblasten und hämogenem Endothel ist eine Herausforderung, da beide bi-potential sind. Hämangioblasten sind BL-CFCs (Koloniebildende Blasten) welche die Faktoren Flk1 (KDR oder VEGFR-2), Tie2, GATA2, Runx1; Scl, SCA-1 und CD34 exprimieren. Eine CD45, CD31+, CD144+ KDR+ Kultur hat hämopoetisches und endotheliales Potential. In einer Endothelzellkultur entwickeln diese Zellen endotheliale Eigenschaften wie Dil-Ac-LDL Up-take, Expression von CD31 (PECAM), CD144 (VE-cadherin) (Wang 2004). Liu et al. entdeckten einen Typ von Blasten (BC) aus humanen embryonalen Stammzellen, die CD34, CD31 und KDR negativ sind aber hämatogenes und endotheliales Potential haben und in glatte Muskelzellen und mesenchymale Stammzellen differenzieren.

Lancrin et al.: Die Gruppe untersuchte BL-CFC aus hESC (humane embryonale Stammzellen) und zeigte, dass Hämangioblasten hämatopoetisches Potential haben wobei sie dabei ein HE-Stadium durchlaufen. Das endotheliale Potential der HE-Zellen zeigte sich durch die Expression von CD34, CD31, Flk1, endoglin und CD144. Sobald Tie2c-kit+CD41- HE Zellen aus BL-CFCs oder Mäuseembryonen auf OP9 Stromazellkulturen kultiviert wurden, differenzierten sie zu CD41+CD45+ hämatopoetischen Zellen. Das bedeutet, dass Blasten – das sind frühe Vorläuferzellen die befähigt sind Zellcluster zu bilden – zuerst ein Zellstadium durchliefen in dem sie eindeutig als Endothelzellen zu identifizieren waren und danach zu Blutzelllinien bildenden Stammzellen weiter differenzierten.

Eilken et al. gingen einen anderen Weg. Sie zeigten die Entstehung von hämatopoetischen Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen indem sie die Differenzierung von Flk1+E-cadmesodermalen Vorläufern einzelner Zelllinien zurückverfolgten. Mesodermale Vorläuferzellen wurden auf OP9 Stromazellkulturen zur hämatopoetischen Differenzierung gebracht, wo diese eine endotheliale Zellschicht bildeten bevor daraus hämatopoetische Zellen hervor gingen.

Rafii et al.: Fügt man in Endothelbuchten (vaskular niche) (E4ORF1+ECs) hESC die Wachstumsfaktoren BMP4, FGF2, VEGF bei, differenzieren diese zu CD144+ Endothelzellen und dann zu CD41+ hämatopoetische Vorläuferzellen (Seandel 2008; Rafii 2013). In dieser Studie gelang es, die Differenzierung einzelner CD144+Cd41- Endothelzellen in CD144+CD41+ hämatogene Vorläuferzellen direkt zu beobachten.

2008 haben Krenning und Co. beschrieben, dass HS/PC CD34+ Zellen an der Neoangiogenese beteiligt sind, indem sie sich im extrazellulären Gewebe nahe eines Gefäßschadens des mikrovaskulären Gewebes verankern und chemotaktisch die Einwanderung von mononuklären Zellen (MNC CD14+) bewirken. Parakrin durch HGF (hepatocyte growth factor) werden diese mononukleären Zellen (MNC CD14+) dazu veranlasst, eine Metamorphose einzugehen (die Autoren legen sich fest, dass von den CD34+ Zellen gebildetes MCP-1 und IL-8 zur Differenzierung der CD14+ MNC nicht beitragen). Bei dieser Metamorphose verlieren MNC ihre pluripotenten Eigenschaften, ihre CD14+ Identität und differenzieren in Gefäßendothelzellen mit den entsprechenden antigenen Erkennungsmerkmalen, entweder CD31-vWF oder CD144-eNOS, das bedeutet Regeneration von Gefäßschäden.

Die Kommunikation zwischen mirkrovaskulärem Gewebe und Stammzellen im Knochenmark: Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System

Um den Sauerstoff- und Nahrungsstoffwechsel wiederherzustellen, kommt es in den ersten 28 Tagen nach der Operation zu einem mikrovaskulären Remodelling. In diesem pathophysiologischen Prozess der vaskulären und mikrovaskulären Wundheilung wird der Gefäßreparaturschenkel des Renin-Angiotensin-Aldosteron Systems aktiviert, in dem die Monocarboxypeptitase ACE2 durch den Gefäßschaden hochreguliert wird. ACE2 wandelt nun in der Zirkulation Angiotensin I in Angiotensin 1-7 um. Der Rezeptor von Ang-(1-7) an seinen Zielzellen, (hämatopoetische Stammzellen/Progenitorzellen CD34+) ist der Mas-Rezeptor, der an der Oberfläche von hämatopoetischen Stammzellen verstärkt exprimiert wird und so für Ang-(1-7) leicht auffindbar ist.  Hat Ang-(1-7) einmal an die CD34+ hämatopoetischen Stammzellen angedockt, beginnen sich diese Zellen stark zu vermehren und in die Zirkulation auszuwandern, um so an den Ort des Gefäßschadens zu gelangen (Neha Singh et al.). In dieser Arbeit wird ebenfalls gezeigt, dass durch Ang-(1-7) die Verankerung (Adhesion) dieser CD34+ HS/PC Zellen in der extrazellulären Matrix des Zielortes durch Fibronektin hochgradig verstärkt wird und im weiteren Integrin die Bindung dieser HS/PC Zellen an Endothelzellen bewirkt.

Megakaryozyten: CD41+CD42+CD61+

Granulozyten: CD15+, Cd33dim

Monozyten: CD14+CD33brightCD45+

Die hämogene Aktivität von CD144+CD31+CD34CD73- Endothelzellen wurde ebenfalls beschrieben (Choiet al.)

hPSC=>BMP4 FGF2 VEGF Hemmung von TGFß signaling by SB 431542 => HE